Preparación de muestras yCargando
Debido al uso de un sistema tampón continuo sin gel de apilamiento, en la mayoría de los casos las muestras deben tener una concentración adecuada y un volumen pequeño. Utilice unpipetaagregar lentamente la muestra, con 5-10 μg por pocillo, para evitar una disminución significativa en la resolución. Cuandocargando muestra, la fuente de alimentación debe estar apagada. La muestra debe contener un colorante indicador (0,025% azul o naranja de bromofenol) y sacarosa (10-15%) o glicerol (5-10%) para aumentar su densidad, concentrar la muestra y evitar la difusión. Sin embargo, a veces la sacarosa o el glicerol pueden provocar bandas en forma de U en los resultados de la electroforesis, lo que se puede evitar utilizando Ficoll (polivinilpirrolidona) al 2,5%.
Electroforesis
El voltaje para la electroforesis es de 5 a 15 V/cm, generalmente alrededor de 10 V/cm. Para la separación de moléculas grandes, el voltaje debe ser menor, normalmente no superior a 5 V/cm.
Tinción
El tinte fluorescente bromuro de etidio (EB) se usa comúnmente para teñir y observar bandas de ADN en gel de agarosa. EB puede insertarse entre pares de bases de moléculas de ADN, lo que hace que EB se una al ADN. La absorción de luz ultravioleta de 260 nm por parte del ADN se transfiere a EB, y el EB unido emite fluorescencia a 590 nm en la región rojo-naranja del espectro de luz visible. La tinción del gel en una solución de MgSO4 de 1 mmol/l durante 1 hora puede reducir la fluorescencia de fondo causada por EB no unido, lo que facilita la detección de pequeñas cantidades de ADN.
El tinte EB tiene varias ventajas: es fácil de usar, no rompe los ácidos nucleicos, tiene una alta sensibilidad y puede teñir tanto el ADN como el ARN. EB se puede agregar a la muestra y rastrear mediante absorción UV en cualquier momento. Después de la tinción, la EB se puede eliminar mediante extracción con n-butanol.
Sin embargo, el tinte EB es un mutágeno potente y se deben tomar precauciones durante su manipulación, como el uso de guantes de polietileno. La naranja de acridina también es un tinte de uso común porque puede diferenciar entre ácidos nucleicos (ADN, ARN) monocatenarios y bicatenarios. Exhibe fluorescencia verde (530 nm) para ácidos nucleicos bicatenarios y fluorescencia roja (640 nm) para ácidos nucleicos monocatenarios. Además, se pueden utilizar otros tintes como azul de metileno, verde de metileno y quinolina B para teñir.
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Hora de publicación: 20-dic-2023