Ensayo de cometas: una técnica sensible para detectar daños y reparación del ADN

El ensayo Comet (electroforesis en gel unicelular, SCGE) es una técnica rápida y sensible que se utiliza principalmente para detectar daños y reparación del ADN en células individuales. El nombre "Comet Assay" proviene de la característica forma de cometa que aparece en los resultados: el núcleo de la célula forma la "cabeza", mientras que los fragmentos de ADN dañados migran, creando una "cola" que se asemeja a un cometa.

Principio

El principio del Comet Assay se basa en la migración de fragmentos de ADN en un campo eléctrico. El ADN intacto permanece dentro del núcleo celular, mientras que el ADN dañado o fragmentado migra hacia el ánodo, formando la "cola" del cometa. La longitud y la intensidad de la cola son directamente proporcionales a la extensión del daño al ADN.

Procedimiento

1. Preparación celular: Las células que se van a analizar se mezclan con agarosa de bajo punto de fusión y se extienden sobre portaobjetos de microscopio para formar una capa uniforme.
2. Lisis celular: Los portaobjetos se sumergen en una solución de lisis para eliminar la membrana celular y la membrana nuclear, exponiendo el ADN.
3. Electroforesis: Los portaobjetos se colocan en una cámara de electroforesis en condiciones alcalinas o neutras. Los fragmentos de ADN dañados migran hacia el electrodo positivo bajo la influencia del campo eléctrico.
4. Tinción: Después de la electroforesis, los portaobjetos se tiñen con un tinte fluorescente (p. ej., bromuro de etidio) para visualizar el ADN.
5. Análisis microscópico: Utilizando un microscopio de fluorescencia o un software especializado, se analizan las formas de los cometas y se miden parámetros como la longitud de la cola y la intensidad.

Imagen de biorenderizado

Análisis de datos

Los resultados del Comet Assay se evalúan en función de varios parámetros clave:

• Longitud de la cola: Representa la distancia que migra el ADN, lo que indica el alcance del daño en el ADN.
• Contenido de ADN de la cola: El porcentaje de ADN que migra hacia la cola, a menudo utilizado como medida cuantitativa del daño al ADN.
• Momento de cola de oliva (OTM): Combina la longitud de la cola y el contenido de ADN de la cola para proporcionar una medida más completa del daño del ADN.

Aplicaciones

1. Estudios de genotoxicidad: El ensayo Comet se utiliza ampliamente para evaluar los efectos de sustancias químicas, fármacos y radiación en el ADN celular, lo que lo convierte en una herramienta clave para las pruebas de genotoxicidad.
2. Toxicología Ambiental: Ayuda a analizar el impacto de los contaminantes ambientales en el ADN de los organismos, proporcionando información sobre la seguridad de los ecosistemas.
3. Investigación médica y clínica: El Comet Assay se utiliza para estudiar los mecanismos de reparación del ADN, el cáncer y otras enfermedades relacionadas con el ADN. También evalúa el impacto de las terapias contra el cáncer como la radioterapia y la quimioterapia en el ADN.
4. Ciencias de la Alimentación y la Agricultura: Se utiliza para evaluar la seguridad de pesticidas, aditivos alimentarios y otras sustancias, y para estudiar sus efectos tóxicos en modelos animales.

Ventajas

• Alta sensibilidad: Capaz de detectar niveles bajos de daño en el ADN.
• Operación sencilla: La técnica es sencilla, lo que la hace adecuada para la detección de alto rendimiento.
• Amplia aplicación: Se puede aplicar a varios tipos de células, incluidas células animales y vegetales.
• Desafíos de cuantificación: Si bien proporciona datos cualitativos sobre el daño del ADN, el análisis cuantitativo se basa en gran medida en software y técnicas de análisis de imágenes.
• Condiciones experimentales: Los resultados pueden verse influenciados por factores como el tiempo de electroforesis y el pH, lo que requiere un control cuidadoso de las condiciones experimentales.

Limitaciones

El Comet Assay es una herramienta invaluable en la investigación biomédica, las ciencias ambientales y el desarrollo de fármacos debido a su flexibilidad y alta sensibilidad para detectar daños y reparación del ADN. Beijing Liuyi Biotechnology Co. Ltd (Liuyi Biotecnología)Ofrece una cámara de electroforesis horizontal para el ensayo de cometas. Bienvenido a contactarnos para discutir sobre elEnsayo de cometaprotocolo.

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