Principio
La electroforesis con película de acetato de celulosa es un método de electroforesis que utiliza una película de acetato de celulosa como soporte.El fenómeno en el que las partículas cargadas se mueven hacia el electrodo opuesto bajo la acción de un campo eléctrico se llama electroforesis.Dado que cada proteína tiene un punto isoeléctrico específico, si una proteína se coloca en una solución con un pH inferior a su punto isoeléctrico, la proteína se cargará positivamente y se moverá hacia el electrodo negativo.Por el contrario, se desplaza hacia el polo positivo.Debido a que la velocidad de las moléculas de proteínas que se mueven en un campo eléctrico está relacionada con su carga, la forma y el tamaño de las moléculas, se pueden separar diferentes proteínas mediante electroforesis.El suero contiene una variedad de proteínas, todas las cuales tienen puntos isoeléctricos a pH 7,5 o menos.Cuando el suero se coloca en un tampón de pH 8,6 para realizar la electroforesis, todas las proteínas del suero están cargadas negativamente y se moverán hacia el lado positivo en el campo eléctrico.Dado que varias proteínas séricas tienen cargas diferentes al mismo pH, las partículas moleculares tienen diferentes tamaños y, por lo tanto, la velocidad de migración es diferente y se separan mediante electroforesis.Los puntos isoeléctricos y los pesos moleculares de las proteínas séricas se muestran en la siguiente tabla:
| Proteína | Puntos isoeléctricos (PI) | Peso molecular |
| Albúmina | 4,88 | 69 000 |
| α1-gloulina | 5.00 | 200 000 |
| α2-gloulina | 5.06 | 300 000 |
| β-gloulina | 5.12 | 9 000~150 000 |
| γ-gloulina | 6,85~7,50 | 156 000 ~ 300 000 |
El experimento consiste en separar diferentes proteínas en el suero sanguíneo con una membrana de acetato de celulosa (abreviatura CAM) como medio de soporte.CAM es una especie de baño de espuma.ePelícula con buena uniformidad y espesor de 0,1 mm a 1,5 mm, que tiene cierta absorción de agua.
Materiales, instrumentos y reactivos para Electroforesis CAM
Muestras:suero sanguíneo humano sano
Instrumento:fuente de alimentación DYY-6C, tanque de electroforesis DYCP-38C, carga de muestra superior WD-9404
los reactivos
1) membrana de acetato de celulosa 7X9cm
2) Solución tampón de barbitol PH 8,6 (fuerza iónica 0,05-0,09, es 0,06 veces al día): tomar 1,84 g de ácido dietil barbitúrico y luego tomar 1,03 g de pentobarbital dietil sódico, agregar un poco de agua destilada para calentar para disolver y preparar. hasta 1000 ml;
3) Mancha: Ponceau S 0,2 g, tricloroacético 3 g, añadir 100 ml de agua destilada;
4) TBS/T o PBS/T: 45 ml de etanol al 95 %, 5 ml de ácido acético glacial, añadir 50 ml de agua destilada;
5) Solución de limpieza: 70 ml de etanol anhidro, 30 ml de ácido acético glacial.
Método del experimentod
1) Prepare la membrana: sumerja la membrana en la solución tampón de barbitol durante 30 min-8 h, sáquela y retire el exceso de solución con papel absorbente.
2) Carga de muestras: Distinga el lado rugoso y el lado liso de la membrana y marque una línea a 1,5 cm de distancia del extremo superior del lado rugoso.Cargue las muestras mediante una herramienta de carga de muestras superior en el lado rugoso.Nota: Las muestras deben cargarse en el lado rugoso de la membrana.Después de que las muestras de suero hayan penetrado completamente en la membrana, déle la vuelta a la membrana, coloque el lado rugoso (con las muestras) boca abajo hacia el tanque y el extremo con las muestras se coloca en el electrodo negativo.
3) Electroforesis: Encienda la fuente de alimentación, 0,4~Membrana de 0,6 m A/cm, el tiempo de funcionamiento es de 30 a 45 min.Después de ejecutar la electroforesis, apague la alimentación.
4) Teñir y limpiar: Saque la membrana del tanque y sumérjalait en la solución de tinte durante 5 minutos y luego límpielo en la solución de limpieza una y otra vez de 3 a 4 veces hasta que el color de fondo sea claro.Las proteínas séricas deben mostrarse en las bandas, y normalmente hay cinco zonas, desde el extremo superior hasta la línea marcada: albúmina, α1-gloulina, α2-gloulina, β-gloulina y γ-gloulina.
5) Conservación: poner la electroforesis seca.bandaen una solución limpiadora durante 10 a 15 minutos, luego sáquelo y péguelo en un vidrio limpio; después de que se seque, se convertirá en una película transparente.banda.
ExperimentoResultado
El efecto de separación de las muestras de suero es bueno y no hay fenómeno de cola de banda.La repetibilidad de los resultados varía según los procedimientos de prueba y los métodos del experimentador, y la repetibilidad es alta.
Conclusión
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Hora de publicación: 14-nov-2022