La semana pasada compartimos varias consideraciones sobre el uso de electroforesis con membrana de acetato de celulosa y hoy terminaremos este tema aquí para su referencia.
Selección de Concentración de tampón
La concentración de tampón utilizada en la electroforesis con membrana de acetato de celulosa es generalmente menor que la utilizada en la electroforesis en papel. El pH comúnmente utilizado 8,6BEl tampón arbitral se elige normalmente dentro del intervalo de 0,05 mol/l a 0,09 mol/l. Al seleccionar la concentración se realiza una determinación preliminar. Por ejemplo, si la longitud de la tira de membrana entre los electrodos en la cámara de electroforesis es de 8 a 10 cm, se requiere un voltaje de 25 V por centímetro de longitud de la membrana y la intensidad de corriente debe ser de 0,4 a 0,5 mA por centímetro de ancho de la membrana. Si estos valores no se alcanzan o superan durante la electroforesis, se debe aumentar o diluir la concentración del tampón.
Una concentración de tampón excesivamente baja dará como resultado un movimiento rápido de las bandas y un aumento del ancho de las mismas. Por otro lado, una concentración de tampón excesivamente alta ralentizará la migración de las bandas, dificultando la distinción de determinadas bandas de separación.
Cabe señalar que en la electroforesis con membrana de acetato de celulosa, una parte importante de la corriente se conduce a través de la muestra, lo que genera una cantidad considerable de calor. En ocasiones, la concentración de tampón elegida puede considerarse apropiada. Sin embargo, en condiciones de mayor temperatura ambiental o cuando se utiliza un voltaje más alto, la evaporación del agua debido al calor puede intensificarse, dando como resultado una concentración de tampón excesivamente alta e incluso provocando que la membrana se seque.
Volumen de muestra
En la electroforesis con membrana de acetato de celulosa, la cantidad de volumen de la muestra está determinada por varios factores, incluidas las condiciones de electroforesis, las propiedades de la muestra misma, los métodos de tinción y las técnicas de detección. Como principio general, cuanto más sensible sea el método de detección, menor puede ser el volumen de muestra, lo que resulta ventajoso para la separación. Si el volumen de muestra es excesivo, los patrones de separación electroforética pueden no ser claros y la tinción también puede llevar mucho tiempo. Sin embargo, al analizar cuantitativamente las bandas teñidas separadas utilizando métodos de detección colorimétrica de elución, el volumen de la muestra no debe ser demasiado pequeño, ya que puede dar como resultado valores de absorbancia más bajos para ciertos componentes, lo que lleva a mayores errores en el cálculo de su contenido. En tales casos, el volumen de la muestra debe aumentarse adecuadamente.
Normalmente, el volumen de muestra añadido en cada centímetro de la línea de aplicación de muestra oscila entre 0,1 y 5 µL, equivalente a una cantidad de muestra de 5 a 1000 µg. Por ejemplo, en el análisis de electroforesis de proteínas séricas de rutina, el volumen de muestra agregado en cada centímetro de la línea de aplicación generalmente no excede 1 μL, equivalente a 60 a 80 μg de proteína. Sin embargo, al analizar lipoproteínas o glicoproteínas utilizando el mismo método de electroforesis, es necesario aumentar correspondientemente el volumen de muestra.
En conclusión, se debe seleccionar el volumen de muestra más adecuado en función de condiciones específicas mediante una serie de experimentos preliminares.
Selección de solución de tinción
Las bandas separadas en la electroforesis con membrana de acetato de celulosa normalmente se tiñen antes de la detección. Los diferentes componentes de la muestra requieren diferentes métodos de tinción, y los métodos de tinción adecuados para la electroforesis con membrana de acetato de celulosa pueden no ser completamente aplicables al papel de filtro.
Hay tres principios principales para elegir la solución de tinción paramembrana de acetato de celulosa. En primer lugar,Se deben preferir los tintes solubles en agua a los tintes solubles en alcohol para evitar la contracción y deformación de la membrana causada por la solución colorante de este último. Después de teñir, es importante enjuagar la membrana con agua y minimizar la duración de la tinción. De lo contrario, la membrana podría curvarse o encogerse, lo que afectaría la detección posterior.
En segundo lugar, es preferible seleccionar tintes con fuerte afinidad de tinción para la muestra. En la electroforesis de proteínas séricas con membrana de acetato de celulosa, el negro amino 10B se utiliza comúnmente debido a su fuerte afinidad de tinción por varios componentes de proteínas séricas y su estabilidad.
En tercer lugar, se deben elegir tintes de calidad fiable. Algunos tintes, a pesar de tener el mismo nombre, pueden contener impurezas que dan como resultado un fondo especialmente oscuro después de teñirlos. Esto puede incluso desdibujar las bandas originalmente bien separadas, lo que dificulta su distinción.
Por último, es importante la elección de la concentración de la solución colorante. En teoría, podría parecer que una mayor concentración de solución de tinción daría lugar a una tinción más completa de los componentes de la muestra y a mejores resultados de tinción. Sin embargo, este no es el caso. La afinidad de unión entre los componentes de la muestra y el tinte tiene un cierto límite, que no aumenta con el aumento de la concentración de la solución colorante. Por el contrario, una concentración excesivamente alta de la solución colorante no sólo desperdicia el tinte sino que también dificulta la obtención de un fondo claro. Además, cuando la intensidad del color alcanza un cierto valor máximo, la curva de absorbancia del tinte no sigue una relación lineal, especialmente en mediciones cuantitativas. En la electroforesis con membrana de acetato de celulosa, la concentración de la solución colorante es generalmente menor que la utilizada en la electroforesis en papel.
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Referencia:Electroforesis (Segunda edición) por el Sr. Li
Hora de publicación: 06-jun-2023